شمارش کامل خون
شمارش کامل خون (CBC) یک صفحه خونی است که توسط پزشک یا سایر متخصصان پزشکی درخواست می شود و اطلاعاتی در مورد سلول های موجود در خون بیمار ، مانند شمارش سلول برای هر نوع سلول خونی و غلظت هموگلوبین می دهد. یک دانشمند یا تکنسین آزمایشگاه آزمایش درخواست شده را انجام داده و نتایج CBC پزشکی حرفه ای درخواست کننده را ارائه می دهد.
از قرن نوزدهم شمارش خون از انواع مختلفی برای اهداف کلینیکی استفاده می شود. تجهیزات خودکار برای انجام شمارش کامل خون در دهه 50 و 1960 توسعه یافت. امروزه اکثر شمارش خون شامل یک شمارش کامل خون (CBC) و یک تعداد دیفرانسیل لکوسیت ها (LDC) است که درصد از هر نوع WBC مانند نوتروفیل ها ، ائوزینوفیل ها ، بازوفیل ها ، مونوسیت ها و لنفوسیت ها را نشان می دهد.
سلولهایی که در جریان خون گردش می کنند به طور کلی به سه دسته تقسیم می شوند: گلبول های سفید (لکوسیت ها) ، گلبول های قرمز (گلبول های قرمز) و پلاکت ها (ترومبوسیت ها). شمارش غیرطبیعی زیاد یا پایین ممکن است نشانگر وجود بسیاری از اشکال بیماری باشد ، و از این رو شمارش خون از جمله آزمایشات خون انجام شده در پزشکی است ، زیرا می توانند یک بررسی کلی از وضعیت سلامتی عمومی بیمار ارائه دهند. CBC به طور معمول در طی معاینات فیزیکی سالانه در برخی از حوزه های قضایی انجام می شود.
جسم شناسی (همچنین به آن "ماهی های استخوانی" گفته می شود) برای شمارش کامل خون که معمولاً توسط پزشکان مورد استفاده قرار می گیرد. قالب بالا بیشتر در ایالات متحده استفاده می شود. Hgb = هموگلوبین ، WBC = گلبولهای سفید ، Plt = پلاکت ها ، Hct = Hematocrit.
مترادف تعداد کامل سلول های خون ، شمارش کامل خون (FBC) ، معاینه کامل خون (FBE)
محدوده مرجع
جیوه: 120-1175 گرم در لیتر
WBC: 3.5 / 11 × 109 / L
Plt: 109 / L 140 140-450
Hct: 31-53٪
MeSH D001772
MedlinePlus 003642
eMedicine 94020
کدهای LOINC برای CBC ، به عنوان مثال ، 57021-8
HCPCS-L2 G0306
کاربردهای پزشکی
شمارش کامل خون برای نظارت بر سلامت کلی ، غربالگری برخی بیماری ها ، تأیید تشخیص برخی از شرایط پزشکی ، نظارت بر وضعیت پزشکی و نظارت بر تغییرات در بدن ناشی از درمان های پزشکی انجام می شود.
برای بیمارانی که نیاز به انتقال خون دارند ، ممکن است از شمارش خون برای بدست آوردن داده هایی استفاده شود که به برنامه ریزی یک مقدار درمان کمک می کند. در چنین مواردی فرد باید فقط یک روز خون داشته باشد و باید انتقال گلبولهای قرمز یا پلاکت ها بر اساس آن برنامه ریزی شود. قرعه کشی و شمارش خون های متعدد در طول روز استفاده بیش از حد از گلبوتومی است و می تواند به انتقال اضافی غیرضروری منجر شود ، و درمان اضافی غیر ضروری خارج از دستورالعمل های پزشکی خواهد بود.
روش
یک داروی خلط آور نمونه را از طریق وریدی جمع می کند و خون را به داخل لوله آزمایش حاوی ضد انعقاد خون (EDTA ، گاهی اوقات سیترات) می کشاند تا مانع از لخته شدن آن شود. سپس نمونه به آزمایشگاه منتقل می شود. بعضی اوقات نمونه با استفاده از یک پیپت پاستور برای پردازش فوری توسط یک پیشخوان خودکار از انگشت انگشت کشیده می شود.
قبل از ظهور آنالایزرهای خونساز اتوماتیک ، با شمارش سلول ها در نمونه رقیق شده خون بر روی دستگاهی به نام هموسیتومتر و با مشاهده اسلایدی تهیه شده با نمونه خون خون بیمار (یک فیلم خون ، یا اسمیر محیطی) به صورت دستی انجام می شد. ) در زیر میکروسکوپ. با این وجود ، تعداد سلولهای دستی خون کمتر متداول می شوند و در عوض این فرآیند به طور کلی با استفاده از آنالایزر خودکار انجام می شود.
خودکار
به طور معمول ، تجزیه و تحلیل از زمانی شروع می شود که یک نمونه خون کاملاً مخلوط در یک قفسه در آنالایزر قرار گیرد. این ابزار برای تجزیه و تحلیل عناصر مختلف خون ، از سلولهای جریان ، فوتومتر و دیافراگم استفاده می کند. جزء شمارش سلول تعداد و انواع سلولهای مختلف درون خون را شمارش می کند. یک فتومتر مخصوص به نام هموگلوبینومتر اندازه گیری میزان هموگلوبین است. این کار با افزودن رقیق کننده ای که گلبول های قرمز خون را لیز می کند ، انجام می شود و سپس درون یک کووت اندازه گیری طیف-فوتومتری پمپ می شود. تغییر رنگ لیزات برابر با میزان هموگلوبین خون است. این اطلاعات می تواند برای پزشکانی که مثلاً در تلاشند علت کم خونی بیمار باشد ، بسیار مفید باشد. نتایج چاپ شده یا برای بررسی به رایانه ارسال می شوند.
شمارش سلول های خونی با فلوسیتومتری جریان می یابد هنگامی که مقدار بسیار کمی از نمونه مورد نظر ، رقیق شده و از دیافراگم و یک سلول جریان لیزر عبور می کند. سنسورها تعداد سلولهایی را که از دیافراگم عبور می کنند ، شمارش و شناسایی می کنند. دو سنسور اصلی که مورد استفاده قرار می گیرند ، ردیاب های لیزری و امپدانس الکتریکی هستند. ابزار نوع سلول خون را با تجزیه و تحلیل داده ها در مورد اندازه و جنبه های نور هنگام عبور از سلول ها تعیین می کند. برخی از ابزارهای اندازه گیری ویژگی های مختلف سلول به منظور طبقه بندی آنها.
از آنجا که یک سلول خونی سلول خودکار ، شمارنده بسیاری از سلولها را شمارش می کند ، نتایج بسیار دقیق است. با این حال ، ممکن است برخی از سلولهای غیر طبیعی در خون به طور صحیح شناسایی نشوند ، که نیاز به بررسی دستی نتایج ابزار و شناسایی به وسیله دیگر (مانند میکروسکوپ) از هر سلول غیر طبیعی که ابزار نتوانسته است آنها را طبقه بندی کند. آنالایزرهای پیشرفته پیشرفته می توانند تعداد دیفرانسیل WBC طولانی را ارائه دهند ، که شامل سلولهای اجدادی خونساز ، گرانولوسیتهای نابالغ و گلبولهای قرمز است.
شاخصهای مختلف گلبولهای قرمز (پارامترهای محاسبه شده از نتایج دیگر CBC) اغلب علاوه بر شمارش سلول و هموگلوبین نیز گزارش می شوند. آنالایزرهای اتوماتیک خون ، میانگین مقدار (MCH) و غلظت (MCHC) هموگلوبین موجود در هر گلبول قرمز را محاسبه می کند. اندازه RBC (MCV) و شکل (RDW) نیز برای ارائه اطلاعات تشخیصی اضافی محاسبه می شود. به عنوان مثال ، اگر گلبول های قرمز کوچکتر یا بزرگتر از حد طبیعی باشد ، یا در اندازه سلول های قرمز تغییرات زیادی وجود دارد ، این داده ها می توانند به راهنمایی جهت آزمایش بیشتر و تسریع در روند تشخیص کمک کنند تا بیماران بتوانند سریعاً به آنها احتیاج دارند.
شمارش کامل خون توسط یک آنالایزر خودکار انجام می شود. دیفرانسیلهایی که در اینجا دیده نمی شوند.
آنالایزر اتوماتیک اتوماتیک Sysmex XT-4000i
کتابچه راهنمای
برای محاسبه تعداد سلولهای قرمز و سفید در هر لیتر خون ، از هموسیتومتر (محفظه شمارش که دارای حجم مشخصی از خون رقیق شده برای فعال کردن شمارش با میکروسکوپ) است ، استفاده می شود. (رقیق و خطوط شبکه مقیاس پذیر روی هموسیومتر استفاده می شود زیرا سلولهای زیادی بدون آن کمکها بسیار زیاد هستند.)
برای شناسایی تعداد گلبولهای مختلف ، یک فیلم خون بر روی اسلاید ساخته می شود و تعداد زیادی از گلبول های سفید (حداقل 100) با استفاده از میکروسکوپ شمرده می شوند. این به درصد سلولهایی که از هر نوع هستند ، می دهد. با ضرب این درصد ها بر تعداد کل گلبول های سفید ، می توان تعداد مطلق هر نوع سلول سفید را بدست آورد.
شمارش خون دستی از یک میکروسکوپ سبک استفاده می کند ، معمولاً با یک اسلایز میکروسکوپ تخصصی ، که به آن هموسیتومتر گفته می شود.
شمارش میکروسکوپی دستی در مواردی مفید است که آنالایزرهای اتوماتیک نتوانند سلولهای غیر طبیعی ، مانند سلولهای نابالغ یا غیرعادی (که در بیماران عادی وجود ندارند) را بطور قابل اعتماد شمارش کنند و فقط در خون محیطی با شرایط خاص خونریزی مشاهده می شوند. شمارش دستی در معرض خطای نمونه گیری است زیرا تعداد کمی سلول در مقایسه با آنالیز خودکار شمارش می شود.
این نمای از طریق میکروسکوپ اسلایس هموسیتومتر تخصصی نشان می دهد. شبکه داخلی با کمک به تکنسین در پیگیری اینکه سلولها قبلاً شمارش شده اند ، شمارش سلول ها را ساده می کند.
تکنسین های پزشکی فیلم خون را از طریق میکروسکوپ برای برخی از CBC ها بررسی می کنند ، نه تنها برای یافتن گلبول های سفید غیر طبیعی بلکه همچنین به دلیل تغییر در شکل سلول های قرمز یک ابزار مهم تشخیصی است. اگرچه آنالایزرهای خودکار نتایج سریع ، قابل اعتماد در مورد تعداد ، اندازه متوسط و تغییر اندازه گلبول های قرمز ارائه می دهند ، اما اشکال خاصی را مشخص نمی کنند. همچنین ، برخی از پلاکت های بیماران عادی در خون ضد انعقادی EDTA جمع می شوند ، که باعث می شود آنالیزهای اتوماتیک تعداد پلاکت های غلط غلط را کاهش دهند. کسی که در این موارد اسلایدها را مشاهده می کند ، تعداد زیادی پلاکت را مشاهده می کند و می تواند تخمین زده شود که تعداد پلاکتان کم ، عادی یا زیاد است.
شامل آزمونها
شمارش کامل خون به طور معمول شامل موارد زیر است:
سلولهای سفید
تعداد کل گلبولهای سفید گزارش شده است و یک دیفرانسیل از همه انواع گلبولهای سفید به عنوان درصد و به عنوان یک تعداد مطلق در هر واحد حجم گزارش می کند. WBC بالا ممکن است نشان دهنده عفونت ، لوسمی یا برخی دیگر از اختلالات خون شناختی باشد.
نوتروفیل ها: افزایش تعداد نوتروفیل ها ممکن است نشان دهنده عفونت باکتریایی یا اختلالات میلوپرولیفراتیو باشد. این تعداد ممکن است در عفونت های حاد ویروسی نیز افزایش یابد. کاهش قابل توجه تعداد نوتروفیل ها (نوتروپنی) می تواند باعث سرکوب سیستم ایمنی شود. [8] به دلیل ظاهر تقسیم شده هسته ، نوتروفیل های بالغ بعضی اوقات به عنوان "جدا" گفته می شوند. هسته نوتروفیل های کم پخته تر تقسیم نشده است ، اما دارای نوار یا شکل میله ای است. این نوتروفیلهای کمتر بالغ به "باند" یا "stabs" معروف هستند ("stab" اصطلاحی آلمانی برای میله ") وجود باند ها و پیش سازهای نوتروفیل قبلی ، مانند metamyelocytes ، در دیفرانسیل گلبول های سفید به شیفت چپ گفته می شود. و می تواند نشان دهنده عفونت یا التهاب باشد.
لنفوسیت ها: با برخی از عفونت های ویروسی مانند تب غده بیشتر است. در لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL) و سایر لوسمی های لنفوسیتیک افزایش یافته است. ممكن است با عفونت HIV شمارش كاهش يابد. در بزرگسالان ، لنفوسیت ها بعد از نوتروفیل ها دومین نوع متداول WBC هستند. در كودكان كمتر از 8 سال لنفوسیت ها از نوتروفیل ها شایع تر هستند.
مونوسیت ها: ممکن است در عفونت باکتریایی ، سل ، مالاریا ، تب خال خال کوهی ، لوسمی مونوسیتیک ، کولیت اولسراتیو مزمن و انتریت منطقه ای ایجاد شود.
ائوزینوفیل ها: در عفونت های انگلی ، آسم یا واکنش آلرژیک افزایش یافته است.
بازوفیل: ممکن است در شرایط مرتبط با مغز استخوان مانند لوسمی یا لنفوم افزایش یابد.
میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) از خون طبیعی در گردش انسان. می توان گلبول های قرمز و چندین گلبول سفید را نشان داد ، از جمله لنفوسیت ها ، مونوسیت ها ، نوتروفیل ها و بسیاری از پلاکت های کوچک دیسک.
سلولهای قرمز
تعداد گلبولهای قرمز خون: تعداد گلبول های قرمز به عنوان تعداد مطلق در هر لیتر داده می شود. کم خونی فقر آهن یکی از شرایطی است که به عنوان یک مقدار کم RBC ظاهر می شود.
هموگلوبین
هموگلوبین: مقدار هموگلوبین موجود در خون ، که به گرم در یک دسی لیتر بیان می شود. سطح پایین هموگلوبین نشانه کم خونی است.
هماتوکریت
هماتوکریت یا حجم سلولهای بسته بندی شده (PCV): این کسری از حجم خون کامل است که از گلبولهای قرمز تشکیل شده است.
شاخص های گلبول قرمز
شاخص های RBC معمولاً از سایر پارامترهای اندازه گیری شده RBC محاسبه می شوند. آنها شامل MHC ، MCHC ، MCV و RDW هستند. آنالایزرهای خودکار MCV را مستقیماً اندازه گیری می کنند و از آن و RBC برای محاسبه هماتوکریت استفاده می کنند.
MCV
متوسط حجم بدنه (MCV): متوسط حجم گلبول های قرمز ، که در femtolitres اندازه گیری می شود. اگر مقدار MCV بالاتر یا پایین تر از حد طبیعی پیش بینی شده باشد ، کم خونی به عنوان میکروسیتیک یا ماکروسیتیک طبقه بندی می شود. کم خونی ها در صورتی که MCV در محدوده مورد انتظار باشد طبقه بندی می شوند. سایر شرایطی که می تواند MCV را تحت تأثیر قرار دهد شامل تالاسمی ، رتیکولوسیتوز ، الکل ، شیمی درمانی ، کمبود ویتامین B12 یا کمبود اسید فولیک است.
MCH
میانگین هموگلوبین قشر (MCH): میانگین پیوند هموگلوبین در گلبولهای قرمز ، در پیکوگرام ها.
MCHC
میانگین غلظت هموگلوبین بدن (MCHC): میانگین غلظت هموگلوبین در گلبول های قرمز. در کم خونی هیپوکرومی ، مانند ناشی از کمبود آهن ، MCHC کاهش می یابد.
RDW
عرض توزیع سلول های قرمز (RDW): میزان تغییر در اندازه و شکل گلبول های قرمز را که توسط آنالیز کننده های خودکار محاسبه می شود ، نشان می دهد. تعیین RDW ، همراه با تعداد RBC و MCV ، در تفسیر چندین اختلال خون شناختی مفید است. RDW به عنوان ضریب تغییر توزیع اندازه سلولهای قرمز اندازه گیری می شود.
پلاکت ها
تعداد پلاکت ها داده می شود و همچنین اطلاعاتی در مورد اندازه و دامنه اندازه آنها در خون وجود دارد.
متوسط حجم پلاکت (MPV): اندازه گیری اندازه متوسط پلاکت ها.
نتایج
نمونه ای از مرجع برای شمارش کامل خون. توجه داشته باشید که نام آزمون ، واحدهای اندازه گیری و محدوده مرجع ممکن است بین کشورها و آزمایشگاهها متفاوت باشد. نتایج بیمار همیشه باید با استفاده از واحدها و محدوده های مرجع از آزمایشگاه تولید شده نتایج تفسیر شود.
نمونه ای از محدوده های مرجع برای آزمایش خون گلبول های سفید
تفسیر
برخی از بیماریهای پاتوفیزیولوژیک یا بیماری با افزایش یا کاهش مطلق در تعداد نوع خاصی از سلول در جریان خون تعریف می شود.
بسیاری از حالات بیماری با تغییر در شمارش خون هدر می رود: لکوسیتوز می تواند نشانه ای از عفونت باشد. ترومبوسیتوپنی ناشی از سمیت دارویی است. پانسیتوپنی معمولاً به عنوان نتیجه کاهش تولید مغز استخوان گفته می شود و یک عارضه شایع شیمی درمانی سرطان است.
هموسیتومتر (یا hemocytometer) یک دستگاه محفظه شمارش است که در ابتدا طراحی شده و معمولاً برای شمارش سلول های خونی استفاده می شود.
هموسیتومتر توسط لوئیس-چارلز مالاسز اختراع شده است و از یک میکروسکوپ شیشه ای ضخیم با یک تورفت مستطیلی تشکیل شده است که یک محفظه ایجاد می کند. این محفظه با یک شبکه با لیزر اچ خطوط عمود حکاکی شده است. دستگاه با دقت دستکاری می شود تا ناحیه محدود شده توسط خطوط مشخص شود و از عمق محفظه نیز مشخص شود. بنابراین با مشاهده یک ناحیه مشخص از شبکه ، می توان تعداد سلول ها یا ذرات را در یک حجم مشخص از مایعات حساب کرد و از این طریق غلظت سلول ها در مایعات به طور کلی محاسبه شد. یک نوع هموسیتومتر به خوبی استفاده شده است محفظه شمارش نوبوئر.
هموسیتومتر دو مستطیل نیمه بازتابی اتاق های شمارش هستند.
بارگذاری یک محفظه
شبکه هموسیومتر (جدول را ببینید)
اصول
مساحت شبکه هموسیومتر از 9 مربع 1 1 1 میلی متر (1 میلی متر مربع) تشکیل شده است. اینها از سه جهت تقسیم می شوند. 0.25 x 0.25 mm (0.0625 mm2) ، 0.25 x 0.20 mm (0.05 mm2) و 0.20 x 0.20 mm (0.04 mm2). مربع مرکزی به مربع 0.05 0.0 0.05 میلی متر (0.0025 میلی متر مربع) تقسیم می شود. لبه های بلند شده هموسیتومتر ، درپوش 0.1 میلی متر از شبکه مشخص شده را نگه می دارد و به هر مربع حجم مشخصی می دهد.
مساحت ابعاد در عمق 0.1 میلی متر
1 x 1 میلیمتر 1 میلیمتر 2 100 nL
0.25 x 0.25 میلیمتر 0.0625 میلیمتر 2 6.25 nL
0.25 0.2 0.20 میلیمتر 0.05 میلیمتر 2 5 nL
0.20 x 0.20 میلی متر 0.04 میلیمتر 2 4 nL
میلیمتر 0.05 0.0 0.05 میلیمتر 0.0025 میلیمتر2 0.25 nL
طریقه استفاده
برای استفاده از هموسیومتر ، ابتدا اطمینان حاصل کنید که پوشش مخصوص آن که به محفظه شمارش ارائه شده است به درستی روی سطح محفظه شمارش قرار گرفته است. هنگامی که دو سطح شیشه در تماس مناسب هستند ، می توانید حلقه های نیوتن را مشاهده کنید. در این صورت ، سیستم تعلیق سلولی بر روی لبه قفسه پوشانده می شود تا با عمل مویرگی داخل اتاق خالی مکیده شود که کاملاً اتاق را با نمونه پر می کند. با شمارش مستقیم با استفاده از میکروسکوپ می توان تعداد سلولهای موجود در اتاق را تعیین کرد و سلولهای بصری قابل تشخیص را می توان به صورت متفاوت شمارش کرد. تعداد سلولهای موجود در محفظه برای محاسبه غلظت یا تراکم سلولها در مخلوطی که نمونه از آن حاصل می شود ، استفاده می شود. این تعداد سلول در محفظه تقسیم بر حجم محفظه است ، که از ابتدا مشخص می شود ، با در نظر گرفتن هرگونه رقت و شمارش میانبرها:
که در آن حجم نمونه رقیق شده (پس از رقت) با حجم مخلوط اصلی در نمونه (قبل از رقیق شدن) تقسیم می شود. به عنوان مثال ، اگر حجم مخلوط اصلی 20 میکرولیتر و یک بار رقیق شده باشد (با اضافه کردن رقیق کننده 20μL) ، در این صورت مدت دوم در پرانتز 40μL / 20μL است. حجم مربعات شمارش شده بسته به اندازه در جدول در بالا نشان داده شده است (شکل سمت راست را ببینید). تعداد سلولهای محاسبه شده ، تعداد کل سلولهای شمارش شده در مربعها در یک محفظه است. نسبت سلولهای شمرده شده اعمال می شود اگر همه مربعهای داخلی در یک مربع تنظیم شده شمرده نشوند (یعنی اگر فقط 4 از 20 در یک مربع گوشه ای محاسبه شود ، این اصطلاح برابر است با 0.2).
برای اکثر برنامه ها ، از چهار مربع بزرگ گوشه ای استفاده می شود. سلولهایی که خطوط بالا و چپ را لمس می کنند یا لمس می شوند ، اما سلول های روی یا لمس خطوط راست یا پایین نادیده گرفته می شوند.
قسمت های هموسیومتر (همانطور که از سمت آن مشاهده می شود) مشخص می شوند.
الزامات
سیستم تعلیق اصلی قبل از گرفتن نمونه باید کاملاً مخلوط شود. این تضمین می کند که نمونه نماینده باشد ، و نه فقط یک مصنوعی از ناحیه خاص مخلوط اصلی که از آن گرفته شده است.
از رقت مناسب مخلوط با توجه به تعداد سلولهایی که باید شمارش شوند استفاده می شود. اگر نمونه به اندازه کافی رقیق نشود ، سلول ها بسیار شلوغ و شمارش دشوار خواهند بود. اگر خیلی رقیق باشد ، اندازه نمونه کافی نخواهد بود تا استنباط های قوی در مورد غلظت موجود در مخلوط اصلی ایجاد شود.
با انجام آزمایش اضافی در محفظه دوم ، می توان نتایج را مقایسه کرد. اگر آنها بیش از 2 برابر خطای شمارش (ریشه مربع شمارش [6]) داشته باشند ، روش گرفتن نمونه ممکن است غیرقابل اعتماد باشد (مثلاً مخلوط اصلی کاملاً مخلوط نشده باشد).
محفظه شمارش باید بعد از قرار دادن درب محفظه (پوشش مخصوص پوشش با ضخامت و صاف بودن) با عمل مویرگی پر شود. این امر از خطر اینكه سلولها می توانند قبل از قرار دادن پوشش در بالای صفحه و رساندن آن به شیشه یا مقداری حجم از آن ، تبخیر شوند ، جلوگیری می كند و در نتیجه بیش از حد غلظت سلول به وجود می آید. رسوب زدایی با باکتری ها کمتر مشکل دارد اما تبخیر ، که بیشتر در آزمایشگاه های با تهویه مطبوع با رطوبت کم رواج دارد ، هنوز باید به حداقل برسد.
شبکه هموسیتومتر خالی با قدرت 100 برابر.
کاربردها
حالی که برخی دیگر به زنده ماندن سلول بالایی احتیاج دارند.
در میکروبیولوژی ، واحد تشکیل کلونی (CFU ، cfu ، Cfu) واحدی است که برای تخمین تعداد باکتریهای زنده یا سلولهای قارچی در یک نمونه استفاده می شود. زنده به عنوان توانایی ضرب از طریق شکافت باینری تحت شرایط کنترل شده تعریف می شود. شمارش با واحدهای تشکیل دهنده مستعمره مستلزم کشت میکروب ها است و برخلاف معاینات میکروسکوپی که تمام سلول ها ، زنده یا مرده را شمارش می کند ، فقط میکروب ها قابل کشت است. ظاهر بصری یک کلونی در یک سلول سلولی رشد قابل توجهی را می طلبد و در هنگام شمارش کلنی ها مشخص نیست که آیا این کلونی از یک سلول یا یک گروه از سلول تشکیل شده است. بیان نتایج به عنوان واحدهای تشکیل دهنده مستعمره نشانگر این عدم قطعیت است.
تئوری
هدف شمارش صفحات تخمین تعداد سلولهای موجود براساس توانایی آنها در ایجاد مستعمرات در شرایط خاص محیط مغذی ، دما و زمان است. از لحاظ تئوریکی ، یک سلول زنده می تواند از طریق همانندسازی مستعمره ایجاد کند. با این حال ، سلولهای انفرادی از نظر ماهیت از این قاعده مستثنی هستند ، و به احتمال زیاد مادر بزرگ مستعمره ، توده ای از سلولهایی بود که در کنار هم قرار گرفته بودند. تخمین تعداد میکروبی توسط CFU ، در بیشتر موارد ، به دلیل این دلایل تعداد سلولهای زنده موجود در یک نمونه را کم خواهد کرد. دلیل این است که شمارش CFU فرض می کند که هر کلونی جداگانه است و توسط یک سلول میکروبی قابل دوام ایجاد شده است.
تعداد صفحه برای E. coli در محدوده 30 تا 300 CFU بر روی یک بشقاب استاندارد با اندازه استاندارد Petri خطی است. [2] بنابراین ، برای اطمینان از این که یک نمونه CFU در این محدوده حاصل می کند ، نیاز به رقیق شدن نمونه و آبکاری چندین رقت است. به طور معمول از رقت ده برابر استفاده می شود ، و سری رقت در تکرارهای 2 یا 3 در محدوده انتخاب شده از رقت ها روکش می شود. صفحه / CFU / صفحه از صفحه در محدوده خطی خوانده می شود ، و سپس CFU / g (یا CFU / میلی لیتر) اصلی به صورت ریاضی به دست می آید ، فاکتورینگ در مقدار انداخته شده و فاکتور رقت آن است.
رقیق ساخته شده با باکتریها و آب پاشیده شده در صفحه آگار (شمارش صفحه آگار برای نمونه های غذا یا سویا تریپتیکاز سویا برای نمونه های کلینیک) قرار می گیرد و با نوک زدن در الگوی نشان داده شده روی صفحه پهن می شود.
مزیت این روش این است که گونه های مختلف میکروبی ممکن است مستعمره هایی ایجاد کنند که کاملاً متفاوت از یکدیگر هستند ، هم از نظر میکروسکوپی و هم از نظر ماکروسکوپی. مورفولوژی کلونی می تواند در شناسایی میکروارگانیسم های موجود بسیار مفید باشد.
درک قبلی از آناتومی میکروسکوپی ارگانیسم می تواند درک بهتری از چگونگی ارتباط CFU / میلی لیتر مشاهده شده با تعداد سلولهای زنده در میلی لیتر داشته باشد. از طرف دیگر می توان تعداد سلولها را در بعضی از موارد در CFU با گرداب نمونه قبل از انجام رقت کاهش داد. با این حال بسیاری از میکروارگانیسم ها ظریف هستند و در کاهش تعداد سلول هایی که در گرداب قرار گیرند قابل استفاده است.
محلول باکتریها در غلظت ناشناخته اغلب به منظور دستیابی به حداقل یک صفحه با تعداد قابل توجهی از باکتریها بطور سریال رقیق می شوند. در این شکل صفحه "x10" برای شمارش مناسب است.
نماد ورود به سیستم
غلظت واحدهای تشکیل دهنده مستعمره را می توان با استفاده از نماد لگاریتمی بیان کرد ، جایی که مقدار نشان داده شده ، لگاریتم پایه 10 غلظت است. این اجازه می دهد تا کاهش ورود به سیستم از یک فرایند آلودگی به عنوان یک تفریق ساده محاسبه شود.
استفاده می کند
واحدهای تشکیل دهنده مستعمره برای تعیین کمیت نتایج در بسیاری از روش های آبکاری و شمارش میکروبیولوژیکی استفاده می شوند ، از جمله:
روش پور پلات که در آن نمونه در یک ظرف پتری با استفاده از آگار مذاب خنک شده در دمای 40-45 درجه سانتیگراد معلق است (دقیقاً بالاتر از نقطه استحکام برای به حداقل رساندن مرگ سلولی ناشی از گرما). پس از محکم شدن آگار مواد مغذی ، صفحه انکوبه می شود.
روش صفحه پخش که در آن نمونه (در حجم کمی) در سطح یک صفحه آگار مواد مغذی پخش شده و اجازه می دهد قبل از جوجه کشی برای شمارش خشک شود.
روش فیلتر غشایی که در آن نمونه از طریق فیلتر غشایی فیلتر می شود ، سپس فیلتر قرار داده شده روی سطح یک صفحه آگار مواد مغذی (باکتری ها در سمت بالا). در حین جوجه کشی ، مواد مغذی از طریق فیلتر خارج می شوند تا از سلولهای در حال رشد حمایت کنند. از آنجا که سطح بیشتر فیلترها کمتر از ظرف استاندارد پتری است ، محدوده خطی شمارش صفحه کمتر خواهد بود.
روش مایلز و میراسرا یا روش قطره بشقاب که در آن یک مقدار کمی از نمونه ها (معمولاً حدود 10 میکرولیتر) از هر رقت به صورت سری روی یک ظرف پتری ریخته می شود. برای جلوگیری از از بین رفتن CFU در هنگام رشد ، جمع آوری ظروف قطره باید خوانده شود.
با این وجود ، با تکنیک هایی که به استفاده از صفحه آگار نیاز دارد ، هیچ محلول سیال قابل استفاده نیست زیرا خلوص نمونه قابل شناسایی نیست و امکان شمارش سلول ها یک به یک در مایع وجود ندارد.
ابزار برای شمارش مستعمرات
شمارش کلنی ها به طور سنتی با استفاده از قلم و پیشخوان انجام می شود. این عموماً یک کار ساده است ، اما وقتی تعداد صفحات زیادی ذکر شود می تواند بسیار پر زحمت و وقت گیر باشد. همچنین می توانید از راه حل های نیمه اتوماتیک (نرم افزاری) و اتوماتیک (سخت افزاری + نرم افزاری) استفاده کنید.
روش سنتی شمارش CFU با "پیشخوان کلیک" و یک قلم. هنگامی که مستعمرات تعداد بیشماری هستند ، معمولاً شمارش CFU ها فقط روی کسری از ظرف است.
نرم افزار برای شمارش CFU
مستعمرات را می توان از تصاویر صفحات با استفاده از ابزارهای نرم افزاری شمارش کرد. آزمایش کنندگان معمولاً از هر صفحه ای که باید برای شمارش استفاده کنند ، عکس می گیرند و سپس تمام تصاویر را تجزیه و تحلیل می کنند (این کار را می توان با یک دوربین دیجیتال ساده یا حتی با یک وب کم انجام داد). از آنجا که برای گرفتن یک عکس واحد ، کمتر از 10 ثانیه طول می کشد ، برخلاف چند دقیقه برای شمارش دستی CFU ، این روش به طور کلی زمان زیادی را صرفه جویی می کند. علاوه بر این ، از آن عینی تر است و امکان استخراج متغیرهای دیگر مانند اندازه و رنگ کلنی ها را فراهم می آورد.
OpenCFU یک برنامه آزاد و منبع باز است که به منظور بهینه سازی دوستی کاربر ، سرعت و استحکام طراحی شده است. این طیف گسترده ای از فیلترها و کنترل و همچنین رابط کاربری مدرن را ارائه می دهد. OpenCFU با C ++ نوشته شده است و از OpenCV برای تجزیه و تحلیل تصویر استفاده می کند.
NICE برنامه ای است که در متلب نوشته شده است و روشی آسان برای شمارش مستعمرات از تصاویر را فراهم می کند.
ImageJ و CellProfiler: برخی از ماکروها و افزونه های ImageJ و برخی از خطوط لوله CellProfiler برای شمارش مستعمرات قابل استفاده هستند. این کار اغلب برای دستیابی به یک کار کارآمد ، کاربر را مجبور به تغییر کد می کند ، اما می تواند مفید و انعطاف پذیر باشد. مسئله اصلی عدم وجود رابط کاربری گرافیکی خاص است که می تواند تعامل با الگوریتم های پردازش را خسته کننده کند.
علاوه بر نرم افزارهای مبتنی بر رایانه های رومیزی سنتی ، برنامه هایی برای دستگاه های Android و iOS برای شمارش مستعمره نیمه خودکار و خودکار در دسترس هستند. از دوربین یکپارچه برای عکسبرداری از صفحه آگار استفاده می شود و از الگوریتم داخلی یا خارجی برای پردازش داده های تصویر و تخمین تعداد کلنی ها استفاده می شود.
سیستم های خودکار
بسیاری از سیستم های خودکار برای مقابله با خطای انسانی استفاده می شوند زیرا بسیاری از تکنیک های تحقیقاتی که توسط انسان انجام می شود و سلول های انفرادی را شمارش می کنند احتمال خطای بالایی دارند. با توجه به اینکه محققان بطور مرتب سلول ها را با کمک یک نور منتقل شده شمارش می کنند ، این روش مستعد خطا در زمانی که سلول ها در تعداد کم هستند می تواند تأثیر معنی داری بر غلظت محاسبه شده در محیط مایع اصلی داشته باشد.
سیستمهای کاملاً خودکار نیز از برخی تولید کنندگان بیوتکنولوژی در دسترس هستند. آنها معمولاً گران هستند و به اندازه نرم افزارهای مستقل انعطاف پذیر نیستند زیرا سخت افزار و نرم افزار به گونه ای طراحی شده اند که برای یک مجموعه خاص کار می کنند. از طرف دیگر ، برخی از سیستم های اتوماتیک از الگوی آبکاری مارپیچ استفاده می کنند.
برخی از سیستم های خودکار مانند سیستم های MATLAB اجازه می دهند سلول ها بدون نیاز به رنگ آمیزی آنها شمارش شوند. این امر باعث می شود که مستعمرات برای آزمایش های دیگر بدون خطر کشتن میکروارگانیسم ها با لکه ها مورد استفاده مجدد قرار گیرند. با این حال ، یک نقطه ضعف برای این سیستم های خودکار این است که تمایز بین میکروارگانیسم ها با گرد و غبار یا خراش روی صفحات آگار خون بسیار دشوار است زیرا هم گرد و غبار و هم خراش می توانند ترکیب بسیار متنوعی از شکل ها و ظواهر ایجاد کنند.
یک پیشخوان مستعمره خودکار با استفاده از پردازش تصویر.
واحدهای جایگزین
به جای واحدهای تشکیل دهنده مستعمره ، می توان از پارامترهای محتمل ترین شماره (MPN) و واحدهای اصلاح شده فیشمن (MFU) [نیاز به استناد] استفاده کرد. روش محتمل ترین شماره تعداد سلول های زنده را شمارش می کند و در شمارش غلظت کم سلول یا شمارش میکروب در محصولاتی که ذرات باعث می شوند شمارش صفحات غیر عملی باشد مفید است. واحدهای اصلاح شده فیشمن باکتری های قابل استفاده اما غیر قابل کشت را در نظر می گیرند.
شمارش سلول هر روش مختلفی برای شمارش یا اندازه گیری مشابه سلول ها در علوم زندگی از جمله تشخیص پزشکی و درمان است. این زیر مجموعه مهم از فلوسیتومتری است ، که کاربردهای آن در تحقیقات و کارآزمایی بالینی است. به عنوان مثال ، شمارش کامل خون می تواند به پزشك كمك كند تا تشخیص دهد كه بیمار احساس ناخوشایندی دارد و برای كمك به چه كاری باید انجام شود. شمارش سلول در محیط مایع (مانند خون ، پلاسما ، لنف یا شستشو آزمایشگاهی) معمولاً به عنوان تعدادی سلول در واحد حجم بیان می شود ، بنابراین غلظت (مثلاً 5000 سلول در میلی لیتر) را بیان می کند.
موارد استفاده
روشهای بیشماری در زیست شناسی و پزشکی نیاز به شمارش سلول ها دارد. با شمارش سلولها در یک حجم کوچک شناخته شده ، می توان غلظت رابط کرد. نمونه هایی از نیاز به شمارش سلول ها عبارتند از:
در پزشکی ، غلظت گلبول های مختلف خون ، مانند گلبول های قرمز و گلبول های سفید ، می تواند در مورد وضعیت سلامتی یک فرد اطلاعات اساسی داشته باشد (نگاه کنید به: شمارش کامل خون).
در سلول درمانی ، برای کنترل دوز سلولهای تجویز شده برای بیمار.
به همین ترتیب ، غلظت باکتریها ، ویروس ها و سایر عوامل بیماری زا در خون یا سایر مایعات بدن می تواند اطلاعاتی را در مورد پیشرفت یک بیماری عفونی و میزان موفقیتی که سیستم ایمنی بدن با آن درگیر است ، نشان دهد.
غلظت سلول برای آزمایشات زیادی در زیست شناسی مولکولی باید شناخته شود ، تا بر این اساس مقدار معرفها و مواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش تنظیم شود.
مطالعاتی که میزان رشد میکروارگانیسم ها را بررسی می کنند (به عبارت دیگر: آنها برای ایجاد سلول های جدید چقدر سریع تقسیم می شوند) به شمارش سلول نیاز دارند.
اندازه گیری میزان دوام سلول ، یعنی اندازه گیری و محاسبه کسری از سلول های مرده و زنده ، به عنوان مثال سلول های در معرض سم.
شمارش دستی سلول
روش های مختلفی برای شمارش سلول وجود دارد. برخی ابتدایی هستند و به تجهیزات خاصی احتیاج ندارند ، بنابراین می توان در هر آزمایشگاه بیولوژیکی انجام داد ، در حالی که برخی دیگر به وسایل الکترونیکی پیشرفته متکی هستند.
محفظه شمارش
یک محفظه شمارش ، یک اسلایز میکروسکوپ است که به خصوص برای فعال کردن شمارش سلولی طراحی شده است. اتاق های شمارش شمارش هموسیتومتر و Sedgewick Rafter دو نوع هستند. هموسیتومتر دارای دو اتاقک مشبک در وسط آن است که هنگام شمارش با یک اسلاید شیشه ای خاص پوشانده می شوند. قطره ای از کشت سلولی در فضای بین محفظه و پوشش شیشه ای قرار می گیرد و آن را با مویرگی پر می کند. محقق با نگاهی به نمونه زیر میکروسکوپ ، از شبکه استفاده می کند تا بطور دستی تعداد سلول ها را در یک منطقه خاص از اندازه شناخته شده بشمارد. فاصله جداکننده بین محفظه و پوشش از پیش تعریف شده است ، بنابراین می توان حجم فرهنگ شمارش شده را محاسبه کرد و با آن غلظت سلول ها را تشکیل داد. در صورت افزودن رنگهای زنده ماندن به مایعات ، قابلیت زنده ماندن سلول نیز تعیین می شود.
مزیت آنها ارزان و سریع بودن است. این امر آنها را به روش شمارش مطلوب در آزمایشات سریع بیولوژیکی تبدیل می کند که در آن فقط باید مشخص شود که آیا یک سلول سلولی همانطور که انتظار می رفت رشد کرده است. معمولاً کشت مورد بررسی رقیق می شود ، در غیر این صورت تراکم بالای سلول ها شمارش را غیرممکن می کند. نیاز به رقیق سازی یک ضرر است ، زیرا هر رقیق سازی عدم دقت در اندازه گیری را اضافه می کند.
یک محفظه شمارش
آبکاری و شمارش CFU
برای تعیین کمیت تعداد سلولهای یک کشت ، سلولها را می توان به سادگی روی یک ظرف پتری با محیط رشد آبکاری کرد. اگر سلولها به طور موثری در صفحه توزیع شوند ، می توان به طور کلی فرض کرد که هر سلول یک کلونی یا واحد تشکیل کلونی (CFU) ایجاد می کند. سپس مستعمرات را می توان شمارش کرد و بر اساس حجم شناخته شده کشت که در صفحه پخش شده است ، می توان غلظت سلول را محاسبه کرد. این اغلب به دنبال استادارد ASTM D5465 انجام می شود
مانند اتاق های شمارش ، فرهنگ ها معمولاً باید قبل از آبکاری به شدت رقیق شوند. در غیر این صورت ، به جای به دست آوردن مستعمرات منفرد که قابل شمارش است ، به اصطلاح "چمن" شکل می گیرد: هزاران مستعمره که بر روی یکدیگر قرار دارند. علاوه بر این ، آبکاری کندترین روش از همه است: اکثر میکروارگانیسم ها برای تشکیل مستعمرات قابل مشاهده حداقل 12 ساعت زمان نیاز دارند.
اگرچه این روش می تواند زمان بر باشد ، تخمین دقیقی از تعداد سلول های زنده می گذارد (زیرا تنها آنها قادر به رشد و تشکیل مستعمرات مرئی خواهند بود). بنابراین به طور گسترده در آزمایشات با هدف تعیین کمیت تعداد سلولهای مقاوم در برابر داروها یا سایر شرایط بیرونی مورد استفاده قرار می گیرد (به عنوان مثال آزمایش لوریا-دلبروک یا سنجش محافظت از جنتامایسین). علاوه بر این ، شمارش مستعمرات بر روی صفحات آگار را می توان با استفاده از پیشخوان های مستعمره بسیار تسهیل کرد.
تصویری از کلنیهای استافیلوکوکوس اورئوس که در صفحه آگار (نور منتقل شده) در حال رشد هستند. چنین مستعمرات گسترش یافته همگن برای شمارش CFU مناسب هستند.
شمارش سلول به صورت خودکار
مقاومت الکتریکی
کانتر Coulter وسیله ای است که می تواند سلول ها را شمارش کند و همچنین حجم آنها را اندازه گیری کند. این واقعیت بر این اساس است که سلولها مقاومت الکتریکی خوبی دارند. به عبارت دیگر ، تقریباً برق ندارند. در کانتر Coulter ، سلولها ، شنا کردن در محلول الکتریسیته ، یکی یکی به یک شکاف کوچک مکیده می شوند. طرف شکاف دو الکترود هستند که برق را هدایت می کنند. هنگامی که هیچ سلولی در شکاف نیست ، جریان برق بدون استفاده جریان می یابد ، اما هنگامی که سلول در شکاف مکش می شود جریان مقاومت می کند. کانتر Coulter تعداد چنین رویدادهایی را شمارش می کند و همچنین جریان (و از این رو مقاومت) را اندازه می گیرد ، که به طور مستقیم با حجم سلول به دام افتاده ارتباط دارد. یک سیستم مشابه ، فناوری شمارش سلول CASY است.
کانتر های Coulter و CASY بسیار ارزان تر از فلوسیتمترها هستند و برای کاربردهایی که نیاز به تعداد و اندازه سلول دارند ، مانند تحقیقات چرخه سلولی ، روش انتخاب آنهاست. مزیت آن نسبت به روشهای فوق تعداد زیادی سلول است که می توانند در مدت زمان کمی پردازش شوند ، یعنی: هزاران سلول در ثانیه. این دقت و اهمیت آماری زیادی دارد.
الکترود شمارنده کولتر
فلوسیتومتری جریان
فلوسیتومتری جریان پیشرفته ترین و گران قیمت ترین روش برای شمارش سلول است. در یک فلوسیومتر جریان ، سلولها در یک جریان باریک در مقابل پرتوی لیزر جریان می یابند. پرتو یکی یکی به آنها برخورد می کند و یک آشکارساز نور ، نوری را که از سلول ها منعکس می شود جمع می کند.
فلوسیتومترها تواناییهای دیگری مانند تجزیه و تحلیل شکل سلولها و ساختارهای داخلی و خارجی آنها و همچنین اندازه گیری میزان پروتئینهای خاص و سایر بیوشیمیاییهای موجود در سلولها دارند. بنابراین ، فلوسیتومترها به ندرت صرفاً برای شمارش سلولها خریداری می شوند.
تجزیه و تحلیل تصویر
رویکردهای اخیر استفاده از تصاویر با کیفیت بالا را با استفاده از یک الگوریتم طبقه بندی آماری برای تشخیص خودکار سلول و شمارش به عنوان یک کار تجزیه و تحلیل تصویر در نظر می گیرند. به طور کلی با یک خطای ثابت به عنوان یک فرآیند نوع خارج از خط (دسته ای) انجام می شود. برای این منظور طیف وسیعی از تکنیک های طبقه بندی تصویر قابل استفاده است.
شمارش سلول های استریولوژیکی
در حال حاضر ، شمارش سلول های استریولوژیکی با تصمیم گیری دستی برای درج شیء براساس قوانین شمارش استریولوژی بی طرفانه ، تنها روش مناسب برای اندازه گیری سلول بی طرف در بخش های بافت بافت شناسی است ، بنابراین به اندازه کافی کافی نیست که به طور کامل اتوماسیون شود.
شمارش غیر مستقیم سلول
طیف سنجی
سیستم تعلیق سلول کبود است. سلولها نور را جذب و پراكنده می كنند. هرچه غلظت سلول بیشتر باشد ، کدورت نیز بیشتر است. اسپکتروفتومترها می توانند شدت نور را بسیار دقیق اندازه گیری کنند. کشت سلول در یک قایق شفاف قرار می گیرد و میزان جذب نسبت به متوسط به تنهایی اندازه گیری می شود. چگالی نوری (OD) به طور مستقیم با زیست توده موجود در سیستم تعلیق سلول در محدوده معینی متناسب با نوع سلول متناسب است. استفاده از اسپکتروفتومتری برای اندازه گیری کدورت فرهنگ ها به عنوان توربیدومتری شناخته می شود.
این روش طیف سنجی را برای اندازه گیری رشد باکتریها و کاربردهای مرتبط با آن انجام داده است. اشکال اسپکتروفتومتری عدم توانایی آن در تهیه شمارش مطلق یا تمایز بین سلولهای زنده و مرده است.
اسپکتروفتومتر
میکروبیولوژی امپدانس
میکروبیولوژی امپدانس یک روش میکروبیولوژیکی سریع است که برای اندازه گیری غلظت میکروبی (عمدتا باکتری بلکه مخمر) از یک نمونه با نظارت بر پارامترهای الکتریکی محیط رشد استفاده می شود. براساس این واقعیت است که متابولیسم باکتریها ترکیبات بدون بار (یا با بار ضعیف) را به ترکیبات بسیار پر بار تبدیل می کنند و در نتیجه خصوصیات الکتریکی متوسط رشد را تغییر می دهند. غلظت میکروبی در زمان مورد نیاز برای پارامترهای برقی کنترل شده برای انحراف از مقدار پایه اولیه تخمین زده می شود. ابزارهای مختلف (یا در آزمایشگاه ساخته شده یا در دسترس تجاری) برای اندازه گیری غلظت باکتریها با استفاده از میکروبیولوژی امپدانس در دسترس هستند.
درحال پردازش ...
